WGBS 建库关键技术之扩增

来源: 生物360 / 作者: 2018-12-07
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WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing),即全基因组亚硫酸氢盐测序,它既可以覆盖所有甲基化位点,能够绘制单碱基分辨率的全基因组甲基化图谱,还能够配合靶向技术检测低频甲基化信号,但是传统 WGBS 数据存在一个严重的问题, BS 处理后,未甲基化的 C 会转化为 U,而甲基化状态的 C 则保持不变;该过程会导致基因组序列组成发生天翻地覆的改变。

外一个不容忽视的问题是:DNA 聚合酶对于含 U 的模板扩增效率大大下降,扩增的偏好性大大增加。如果能决定这两个问题的话,那 WGBS 将会得到更广泛的应用,特别是对于 ctDNA 的甲基化测序。

为此,KAPA Biosystems(现为 Roche KAPA)利用“分子进化”技术开发的 Kapa HiFi Uracil+ DNA 聚合酶。该酶能高度耐受模板链中的 U,同时保持了高扩增效率和保真性,这使其能够高准确度、有效地扩增亚硫酸盐处理后的 DNA。

高效扩增含尿嘧啶的模板

来源于 KAPA HiFi DNA 聚合酶的尿嘧啶耐受的,具有校正功能的扩增酶

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KAPA HiFi Uracil+ReadyMix 不受 dUTP 抑制。

SYBR® Green 法实时荧光定量 PCR 检测 dUTP 对 PCR 扩增的影响,结果显示 dUTP 可以抑制常规 PCR 反应液的扩增 (左),而 KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix (右) 无扩增抑制 (dUTP 浓度为 0.2 mM,扩增片段长度为 452 bp,模板稀释比例为 80 pM-0.8 fM)。

解锁亚硫酸氢盐转化文库构建的真正潜能

  • 通过更高的文库产量和更少的扩增循环数来降低 PCR 重复和偏差
  • 高扩增效率保证长片段文库构建质量

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KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix 提供更高的文库产量和最小的文库分子大小偏差。

使用 12、14 或 16 个循环的标准方案扩增人类全基因组亚硫酸氢盐处理的文库,并使用 Bioanalyzer® 2100 高灵敏度 DNA 检测系统分析扩增文库。与 A 相比,KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix 的产量更高 (左),片段大小偏差更小 (右)。

与 DNA 甲基化测序应用无缝连接

  • 高效扩增亚硫酸氢盐转化的文库
  • 改善亚硫酸氢盐测序 read 的质量

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KAPA HiFi Uracil+ReadyMix 成功扩增简化亚硫酸氢盐测序文库。

起始量为 500 ng 或 10 ng 的小鼠 B 细胞基因组 DNA,经 MspI 消化后,使用 KAPA HyperPrep Kit 构建文库,及使用 KAPA HiFi Uracil+ ReadyMix 进行最后文库扩增。500 ng 文库扩增 10 个循环,10 ng 文库扩增 15 个循环。(A) 10 ng 文库与 500 ng 文库 (左) 以及两次 500 文库之间 (右) 有着很好的相关性。(B)碱基组成与序列位置关系图显示,测序结果中 >95% 的 reads 都是以 MspI 切割位点 (CCGG) 开头。数据来自 Emory University (Atlanta, GA, USA)。

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