生物物理所揭示噬菌体防御 CRISPR-SpyCas9 的分子机制

来源: 生物物理研究所 / 作者: cas / 时间: 2019-01-03
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2018 年 12 月 31 日,《分子细胞》(Molecular Cell)杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所王艳丽课题组在 CRISPR-Cas 系统研究中取得的最新进展。标题为 Phage AcrIIA2 DNA Mimicry: Structural Basis of the CRISPR and Anti-CRISPR Arms Race。该研究工作成功解析了 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 与 Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) 蛋白及 single-guide RNA (sgRNA) 的三元复合物 3.3 埃的晶体结构,并结合体内和体外的功能实验,系统地阐述了噬菌体运用 Anti-CRISPR 蛋白防御 CRISPR-SpyCas9 系统的分子机制。王艳丽课题组一直致力于 CRISPR-Cas 系统抗病毒作用机理的研究,前期研究揭示了一系列重要的 CRISPR-Cas 系统的作用机理 (Nature 2014, Cell 2015, Cell Res. 2016, Cell 2017a, Cell 2017b, Mol. Cell2017, Cell 2018);该工作是王艳丽课题组首次在 Anti-CRISPR 蛋白防御 CRISPR-Cas 系统作用机理的研究中取得突破。

CRISPR/Cas 系统是古菌和细菌抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统。CRISPR-Cas 系统划分为两大类,第一大类 CRISPR-Cas 系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能;第二大类是由单个效应蛋白(如 Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13 等)来发挥功能。其中,Cas9, Cas12a, Cas12b 均具有 RNA 介导的 DNA 核酸内切酶活性,Cas13a 具有 RNA 介导的 RNA 核酸酶活性。面对细菌的免疫系统(CRISPR-Cas),噬菌体也相应进化出了自己的防御系统(Anti-CRISPR)。2017 年首次发现了 Listeria monocytogenes 噬菌体来源的四个 Anti-CRISPR 蛋白,AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 和 AcrIIA4。研究发现 AcrIIA2 和 AcrIIA4 蛋白在细胞内能够抑制 SpyCas9 的基因编辑活性。随后的结构和功能研究表明 AcrIIA4 通过阻断 DNA 与 SpyCas9 的结合来抑制 SpyCas9 的功能,然而 AcrIIA2 抑制 SpyCas9 活性的分子机制一直未能阐述清楚。

在该研究中,研究人员首先通过生化实验发现 AcrIIA2 只与结合有 sgRNA 的 SpyCas9 二元复合物结合,并不与自由状态下的 SpyCas9 结合,也并不与同时结合有 sgRNA 和 dsDNA 的 SpyCas9 三元复合物结合。为了研究 AcrIIA2 直接抑制 SpyCas9 活性的分子机制,研究人员利用 X -ray 晶体学的方法成功解析了 AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA 的三元复合物晶体结构(3.3 埃)。结构发现 AcrIIA2 是由三个α螺旋及一个β折叠组成的紧凑结构,它结合在 SpyCas9 的一个带正电荷的凹槽区域。该区域由 PI、HNH、WED 和 REC2 结构域形成。PI 结构域上 R1333 和 R1335 是识别 dsDNA 的 PAM 序列的关键氨基酸,AcrIIA2 通过与 R1333 和 R1335 形成稳固的氢键从而阻断 SpyCas9 对 PAM 序列的识别,进而阻止 SpyCas9 对 dsDNA 的结合。而 AcrIIA2 的α1 螺旋与 HNH 结构域的相互作用可以锚定 HNH 结构域,阻止其结合 DNA 必须发生的构象变化。另外,通过结构比对分析发现 AcrIIA2 有大量的带负电荷的氨基酸占据着 dsDNA 中 PAM 结合的位置,这表明 AcrIIA2 模拟带负电荷的 DNA 与 SpyCas9 结合从而阻止 DNA 与 SpyCas9 的结合。有趣的是,竞争性结合实验表明 AcrIIA2 并不能取代已经与 SpyCas9-sgRNA 结合的 dsDNA,而 dsDNA 也不能取代已经与 SpyCas9-sgRNA 结合的 AcrIIA2。总之,通过结构和功能实验的证明,AcrIIA2 主要通过三个步骤来抑制 dsDNA 的结合。首先,AcrIIA2 可以阻断 PAM 的识别;其次,AcrIIA2 占据了 dsDNA 的结合位点;最后,AcrIIA2 通过限制 HNH 结构域的构象变化来抑制 dsDNA 的结合。

目前,SpyCas9 蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用于 DNA 领域的基因编辑,克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点,以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求,并有着潜在的临床应用价值。但是 CRISPR-SpyCas9 基因编辑系统也存在着一定的脱靶问题,该研究对 Anti-CRISPR 蛋白抑制 SpyCas9 活性分子机制的阐述为控制或终止 SpyCas9 活性提供了新的参考和思路。有望将 Anti-CRISPR 蛋白开发成新的基因编辑终止工具,实现精准基因编辑。

王艳丽为论文通讯作者。王艳丽课题组的刘亮为论文第一作者。该研究得到科技部、国家自然科学基金以及中科院战略性先导科技专项(B 类)的资助,上海同步辐射光源(SSRF)以及日本同步辐射光源 SPring- 8 为该研究提供了重要的技术支持。

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图注:AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA 三元复合物的晶体结构。(A)SpyCas9 的结构域;(B)AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA 三元复合物的结构展示图。

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