中国学者 Nature Methods 原创开发可克隆电镜标记技术实现细胞中的单分子定位

来源: 生物通 / 作者: 2020-08-26
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近 50 年来,细胞的电镜成像领域依赖基于传统的抗体免疫金标记技术识别细胞中的蛋白质分子。传统免疫金标记技术,受到抗体及抗原的稳定性和特异性、化学固定剂、细胞切片渗透性,胶体金颗粒大小等因素影响,通常标记效率很低(低于 10%),甚至无法标记,因此,多数情况只能标记上细胞切片表面的极少部分抗原 。此外, 传统免疫标记需要标记每一个切片,对于细胞组织样品大尺度的标记是十分费钱、费时、费力的工作,比如对神经组织样品的系列切片三维分子水平成像需要对数以千计以上切片进行免疫标记。尽管目前超分辨率荧光显微学成像技术已经可以对细胞中的分子进行单分子水平的成像,但因无法对没有标记的多数分子甚至细胞器成像,通常需要借助于非常复杂低效的光镜 - 电镜关联成像技术来弥补,而且当分子富集度很高时也无法区分单个分子。进入基因时代后,细胞生物学家迫切希望电镜领域也能够开发出类似光学显微成像领域广泛应用的 GFP 标记,通过遗传操作来直接实现细胞及生物组织的电镜超微结构样品上单个分子的精准识别与定位,因此,可将此类基于遗传编码的标记技术称为可克隆电镜标记技术(或通俗称之为电镜的 “GFP” 标记技术)。目前科学家们尝试了两类基于遗传编码的可克隆电镜标记技术。第一类是利用标记蛋白介导释放超氧离子聚合 3,3’-diaminobenzenidine 后与重金属离子反应形成高电子密度沉淀物示踪,但因为超氧离子扩散速度极快无法实现单个分子定位,只适合相对密闭空间的高浓度标记分子进行展示,例如 Alice Ting 研究组开发的 APEX 标记。第二类是重金属离子直接与标记蛋白结合形成纳米金属颗粒示踪,例如富含半胱氨酸的金属结合蛋白(Metallothionein,简称 MT;抗冻蛋白 AFP 等)以及铁蛋白多聚合体(ferritin),但铁蛋白多聚合体太大不适合做单分子标记。2006 年 David DeRosier 研究组首次提出利用纯化的 MT 蛋白结合金离子可形成纳米金颗粒的特性可用来开发可克隆电镜标记。随后其他几个小组尝试利用 MT 开发可克隆标记技术,然而受技术限制(如高背景噪声导致特异性差,金离子无法有效进入细胞,合成金颗粒效率低,金颗粒太小等),迄今没有开发出适合细胞超微结构成像的可克隆电镜标记技术。何万中研究组基于 David DeRosier 提出的 MT 标记概念,设计改造 MT(MTn,MTα), 并尝试了其他富含半胱氨酸蛋白(如抗冻蛋白 AFP),开展了可克隆电镜标记技术的研发。经过十年的长期探索积累,何万中研究组攻克了基于富含半胱氨酸的金属结合蛋白的可克隆电镜标记技术的一系列技术挑战,终于研发出适合细胞中单分子识别与精确定位的可克隆电镜标记技术。

其关键技术突破简要介绍如下:基于 Brust-Schiffrin 方法(BSM)合成硫醇(RSH)包被的纳米金颗粒原理(图 1b),何万中研究组从研究硫醇阴离子(RS-)浓度与三价金离子(Au3+)的比率(RS-/Au3+)在 BSM 合成金颗粒的作用入手,发现:传统的 BSM 金颗粒合成都是基于 RS-/Au3+

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