CRISPR 破解基因组“暗物质”功能之谜

来源:生物通 / 作者: / 2016-11-11
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基因组“暗物质”已经从所谓的“垃圾”DNA 变成了炙手可热的研究领域,揭示它们的奥秘对于破解人类遗传谜题,研发更好的疾病治疗方法具有重要意义。

清华大学生命科学学院高冠军研究组将优化后的 CRISPR 技术运用于 lncRNA 活体功能研究领域,以基因组强净化的遗传学鼻祖模式生物——果蝇为代表,通过高通量遗传动物模型的建立,系统阐述了长链非编码 RNA(lncRNA)在精子发生过程中的重要作用,为揭示“暗物质 lncRNA”具有重要生物学功能提供了大量的遗传学证据。

这一研究成果公布在 Genome Research 杂志上,领导研究的是清华大学生命科学学院 PI 高冠军博士,其研究组实验室在国际上率先建立的 CRISPR 与 phiC31 重组酶相结合的高效果蝇基因打靶系统(knock-out 和 knock-in),并利用这一系统取得了不少重要发现。为了进一步了解最新这项研究,生物通特联系了高博士,就读者感兴趣的问题请教了他。

本世纪初,伴随高通量测序技术发展,构成真核生物基因组中的大量“暗物质”——lncRNA 被鉴定出来,且在睾丸和脑组织中呈现高度特异性表达,暗示 lncRNA 的功能机制在精子发生与神经调控两个基础生命学过程具有代表性。

高冠军研究小组选择基因强净化的模式生物果蝇,系统性鉴定了 128 个睾丸特异性表达的 lncRNA。并运用优化后的 CRISPR 技术建立了 105 个 lncRNA 基因敲除体。通过对雄性果蝇育性测试、精子发生、发育、活力及核形态等进行观察分析,研究人员发现近 1 / 3 的 lncRNA 基因的缺失会导致精子发育异常甚至完全不育。

同时部分测试的 lncRNAs 敲除果蝇均可通过易位转基因得以完全或部分修复,表明这些 lncRNAs 主要以反式(trans)发挥作用。基因表达谱显示,大部分功能性 lncRNAs 在精子发生中调控全局基因的表达。进化分析表明,与编码基因相比,lncRNAs 演化更快,且具有更大功能重要性的 lncRNAs 具有较高的序列保守性,暗示它们处于不断的进化选择之下。

另外,与蛋白编码基因的开关调控作用不同,lncRNA 可能多通过微调的方式调控全局基因表达,精心策划雄性生殖细胞分化。总之,该研究弥补了大量功能性 lncRNA 在动物活体水平所缺乏遗传学证据的空白,开启了 lncRNA 所传递的生命信息研究的大门。

高博士:传统的研究认为,编码人类蛋白质的基因只有 2~3 万个,且只占全基因组的占 2% 左右。而超过 95% 的人类基因组并不编码蛋白质基因,而是构成了生命“暗物质”——非编码 RNA。近年来,越来越多的具有生物学功能的非编码 RNA 被鉴定出来。然而,相对于数目庞大的非编码 RNA(包括大量的长链非编码 RNA,通常 >200nt)来讲,这只是冰山一角。

本项目的目的就是通过高通量遗传动物模型的建立,来系统阐述了长链非编码 RNA(lncRNA)在生物进化中的作用,为揭示“暗物质 lncRNA”是否具有重要生物学功能提供遗传学证据。

与蛋白质编码基因不同,lncRNAs 表达丰度较低,通常会与蛋白质形成高级结构发挥作用,探讨 lncRNAs 功能可用 gain/loss of function 策略,过表达或沉默 lncRNAs 后观察表型。但目前广泛应用于 lncRNAs 研究的 RNAi knock down 技术只能部分沉默基因,所以用 RNAi 敲低 lncRNAs,其表型可能会非常微弱以致无法观察表型。另外,相较于蛋白编码基因,lncRNAs 的保守性较差,导致 lncRNAs 无法像蛋白编码基因一样来根据序列推测其保守的功能结构域,再针对该结构域进行 knock down,这在很大程度上降低了 lncRNAs knock down 的效果。

同时,由于 lncRNAs 被发现在睾丸和脑组织中呈现高度特异性表达,暗示 lncRNAs 的功能机制在精子发生与神经调控两个基础生命学过程具有代表性。然而,目前未有针对精子发生过程 lncRNAs 的大规模研究报道。

基于以上两方面考虑,本实验室研究 lncRNAs 功能的基本思路是:首先,通过生物信息学预测和 Flybase 已有注释,系统性鉴定出在果蝇睾丸组织几乎所有特异性表达的 lncRNAs。其次,我们对 CRISPR 技术进行了优化,以适合 lncRNAs 功能研究。运用优化后的 CRISPR 技术,我们建立起 100 个左右 lncRNAs 基因完全敲除的果蝇突变株。之后,通过对突变体雄性果蝇育性测试、精子发生、发育、活力及核形态等进行观察分析,我们筛选出在果蝇精子发生中具有重要功能的 lncRNAs。最后,通过高通量 RNA 测序和进化分析,我们对 lncRNAs 可能的作用机制进行了研究。

研究结果与我们的预测基本一致,有近 1 / 3 的 lncRNAs 基因缺失会导致精子发育异常甚至完全不育。该研究弥补了大量功能性 lncRNA 在动物活体水平所缺乏遗传学证据的空白,开启了 lncRNA 所传递的生命信息研究的大门。

高博士:果蝇基因敲除的传统方法——基因打靶,包括 ends-in 与 ends-out 均基于φC31 整合酶系统介导的位点特异性交换,依赖于生物体内自身的 DNA 修复系统,将基因组上目的基因的靶位点序列置换为供体质粒上的序列。然而,传统基因打靶技术流程复杂,周期长,需耗费大量人力与时间,不适合大规模筛选使用。

锌指核酸酶(ZFN)与转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)用于基因打靶的局限在于,针对每一个候选基因,均需构建和筛选针对该基因的特异性结合蛋白,从而限制了该方法运用于大规模基因敲除。因此,在模式动物水平,以基因敲除方法大规模研究 lncRNAs 的功能,需要快速简洁的规模化基因敲除方法介入。

2013 年 1 月以来,一种新的基因编辑技术 CRISPR/Cas 引起了广泛关注。CRISPR 是在细菌及古细菌中广泛存在的免疫系统。针对特定基因,可以通过人工构建两个 RNA 的嵌合体构成定向 RNA,模拟 crRNA 与 tracrRNA 特异识别基因序列,再通过人工表达 Cas9 蛋白对特定 DNA 序列进行切割产生 DNA 双链损伤,在修复时引入突变或移码即可得到目标基因的敲除突变体。CRISPR 系统的迅速发展,极大地减少了基因敲除所需的工作量和周期,使得通过大规模敲除而研究 lncRNAs 的功能机制成为可能。因此,CRISPR 基因编辑是目前解决 lncRNAs 功能的最强有力的方法之一。

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