液体活检技术的进步——CAPP-Seq

来源: / 作者: / 2016-03-30
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循环肿瘤 DNA(ctDNA)对于评估癌症符合来说是一个很有前景的非侵入性方法,但是目前检测 ctDNA 的方法存在敏感性受限或病人覆盖率的不足,作者通过深度测序癌症个性化图谱 cancerpersonalized profiling by deep sequencing (CAPP-Seq),量化 ctDNA,对非小细胞肺癌(NSCLC)进行 CAPP-Seq,设计的突变点覆盖超过了 95% 的 NSCLC。

为了设计这个 NSCLC“筛选器”,作者从 COSMIC 和其他数据库中挑选了潜在驱动基因的覆盖复发突变的外显子,在 TCGA 中 407 个 NSCLC 行全外显子测序,并运用迭代算法,以选择最少的位点涵盖最多的错意突变病人数。

Fig1 CAPP-Seq 设计方案:

六步设计了这个 NSCLC 筛选器:1. 检测非小细胞肺癌中捕获的已知和可疑的驱动突变,2-4. 增加了含有复发性单核苷酸变异 SNVs 的外显子,5-6. 增加了内含子和在基因重排断裂位点外显子(ALK、ROS1、RET),最后检测的长度达到 125kb,靶向设计了 521 外显子,13 个内含子,中位检测 SNVs 是 4 个,覆盖 96% 的 NSCLC。在训练集及验证集中达到高度一致性。

Fig2 概括了 CAPP-Seq 的数据特征:

血浆中循环 DNA 片段的长度分布,大部分落在 170bp(fig2a),所有基因组(b)及 4 个病人(c)血浆 DNA 测序深度的范围,可见大多在 10000×,有很好一致性。

CAPP 中非参等位基因分布,发现本底中位值和均值分别是 0.0003%、0.006%,这远远低于 ctDNA 比例,说明并不会影响 ctDNA 检出(fig2d)。多种非肿瘤组织(如一些癌前细胞)可以释放出非生殖系 ctDNA,这样的生物学本底(或背景)同样影响 CAPP-Seq 的敏感性,因此分析 40 份血浆中(35 份 NSCLC,5 份正常)107 个癌症相关 SNVs,发现大部分都在底下,<0.01%(其实还有相当一部分是在这个值以上的)(e),并检测了一些热点突变发现 TP53 R175H 频率特别高 ~0.18%,其他的都在 0.01% 以下,故需要排除 TP53 R175H,以免影响真实的生物学克隆异质性(f)。

下一步作者就是开始以经验为基准的检测了 CAPP-Seq 的检测极限和检测结果的线性相关,说明在不同稀释程度下实际检测和理论检测有较高的一致性。

虽然本底较低,但 CAPP-Seq 要基于充足的血量,对于获取有限血量的标本来说(如贫血、并发症、身体机能差等)这样的本底还是大大限制了 ctDNA 的检出率,而影响 ctDNA 量主要是 1、文库中 cfDNA 重新获取的量,2、肿瘤特异性 ctDNA 量。

左图可见 ctDNA 等位基因频率在 0.2% 本底误差开始逐渐明显,而达到 CAPP-Seq 检测极限 0.02% 时人工误差达到 50%,因此降低误差是尤为重要。故作者今年对 CAPP-seq 进行了优化,引进了集成数字误差抑制 (integrated digital error suppression,iDES),结合肿瘤中消除原本较高的本底噪音和分子条码技术策略,从而获得有效的 cfDNA,大大降低了本底噪音。这两种方案能分别使 CAPP-seq 敏感性提升 3 倍,而结合后提升 15 倍,右图所见。

iDES 设计

利用两个插入条码、两个索引条码及适配器组装双链 DNA,分别扩增,最后得到相对较纯反义链,再重新组装成 - 无 PCR 扩增产生的随机突变 - 无探针富集时由氧化导致的单链突变 - 拥有真实突变的双链 DNA(a),结合条码技术及背景抛光协同使无错误位点从 90% 升至 98%,全误差率低至 0.0015%(b),b 中还可见 G>T 的颠换发生错误最大。

17 个患者基本信息及治疗前 CAPP-Seq 检测的结果

可见有两例 I 期患者(p12、p17)没有检测出 ctDNA,而其余 II~IV 期都有检测出,且 IV 期的看似 ctDNA 量要多点,但是也有例外如 p4 患者,虽然是 IV 期,但是 ctDNA 量反而没 III 期的多,是否其肿瘤活性较低引起有待思考,有融合基因的几乎都是没有抽烟及抽烟较轻的患者,这些患者 SNVs 也较少。

对 Table1 中 13 个 NSCLC 患者和 5 个健康人进行 CAPP-Seq 后分析其敏感性及特异性发现 II~IV 期患者敏感性和特异性达到了 100% 和 96%(fig3a),且肿瘤大小与 ctDNA 量成正相关(c)。

iDES-enhancedCAPP-Seq 特征

采用 iDES 可使假阳性基本消失,敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值都达到最大,并且与 ddPCR 对比,等位基因频率有较高的一致性。

检测肿瘤热点突变中 iDES 能使阳性预测值 PPV 提升至 70%,并且能使肿瘤配对样本中没有检测的 cfDNA 达到最低(d)。在检测 EGFR 突变中发现敏感性和特异性同时达到 100%,而针对不同突变 L858R、Exon 19 del、T790M 时特异性和 PPV 达到 100%,敏感性也有 91%~96%(e、f)。

CAPP-Seq 临床应用

(fig4)基于 CAPP-seq 检测 NSCLC 患者 ctDNA 监测肿瘤负荷,可见 ctDNA 不仅能很好的反应肿瘤大小,还能反应出肿瘤的活性(e),且比影像学更加灵敏。也有例外如(f)治疗后肿瘤体积缩小了,但 ctDNA 反而上升了,这里不好解释了。

iDES-enhancedCAPP-Seq 临床应用

iDES 的检测极限达到 0.0025%,这里的 c 只有用 iDES 在肺癌治疗 1 个月肿瘤负荷相对较低的时候才能检测出,而其他方法都检测不出。真因为 iDES 检测的阳性预测值更高了,这也可以解释上图中 f,可能是由于假阳性的结果。

总结

用 CAPP-seq 可检测 100% 的 II~IV 期 NSCLC,I 期检测是 50%。该方法特异性高达 96%,能检测突变等位基因频率低至 0.02%。ctDNA 水平与肿瘤大小高度一致性,能反应残余病灶及治疗相关的影像学反应,并且比影像学更加灵敏。而在此基础上的 iDES 能是从血中检测 EGFR 激酶区域突变谱敏感性达到 92%,特异性达到 99.99%,在患者水平其敏感性和特异性分别是 90% 和 96%,此外 iDES 能监测 NSCLC 患者 105cfDNA 中 4 个 ctDNA。我们可以预测 iDES-enhanced CAPP-Seq 将辅助非侵入性基因分型及在临床中发挥其优势。

参考文献:

Nat Med. 2014May;20(5):548-54. An ultrasensitivemethod for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.

Nat Biotechnol. 2016May;34(5):547-55. Integrated digital error suppression forimproved detection of circulating tumor DNA.

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钟老师,走好!!!

天道有轮回 苍天饶过谁 该来的总会来 谁阻止都没用

文中的注意眨眼是否应为注意瞬脱范式?

广东省的护士可以吗?

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