微生物所等开发出基于毒素 - 抗毒素系统的基因编辑新技术

来源:微生物研究所 / 作者: / 2017-02-08
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高效的基因编辑技术是基础生物学和生物技术研究的核心技术,在生命科学和生物医学等领域扮演着日益重要的角色。基于细菌和古菌防御系统建立的高效遗传操作技术是基因组编辑领域的研究热点,如利用限制性修饰(RM)系统建立的 DNA 甲基化模拟系统(MoDMP)和利用规律成簇的间隔短回文重复序列建立的 CRISPR 技术。最近发现,毒素 - 抗毒素系统(Toxin-Antitoxin system)通过利用位于同一操纵子上的毒素和抗毒素基因的编码产物调节细胞的生长与死亡 / 休眠,使其适应各种胁迫条件,是原核细胞中普遍存在的一种防御系统。这种能特异调节细胞生长与死亡的机制能够被应用于细菌 DNA 克隆、蛋白表达和遗传操作中。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)作为一种革兰氏阳性细菌的模式菌,其遗传操作系统在各种生理代谢、信号调控以及系统代谢工程等研究中起着重要作用。尽管在芽胞杆菌中已建立了位点特异重组酶介导方法、反筛方法以及 CRISPR-Cas9 等基因编辑技术,但是革兰氏阳性细菌的细胞壁结构复杂、细胞抵抗毒性能力强等特点导致遗传操作的假阳性率高。因而,现有的遗传操作方法无法高效稳定地对芽胞杆菌等大多数的革兰氏阳性细菌进行基因编辑。

针对革兰氏阳性细菌缺乏高效、稳定的无痕遗传操作系统的这一瓶颈问题,中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室温廷益研究组和军事医学科学院毒物药物研究所车永胜研究组开展了合作研究,将细菌毒素—抗毒素系统重编程为由抗毒素开关调控的毒素反筛模块(Toxin Counter-selectable Cassette Regulated by an Antitoxin Switch, TCCRAS),并经过优化使其适用于枯草芽胞杆菌和谷氨酸棒状杆菌等革兰氏阳性细菌的基因编辑。首先,利用组成型与诱导型启动子分别启动毒素与抗毒素基因表达的策略,构建了抗毒素开关调控的毒素反筛模块(TCCRAS);通过筛选五种不同来源的 II 型 TA 系统获得了一个高效的反筛模块 relBE,并构建了携带 TCCRAS 系统的遗传操作载体。利用该系统可以在枯草芽胞杆菌中高效实现功能基因的缺失、插入、替换、精确点突变与大片段 DNA 的插入与删除(最高达 194.9kb),并通过插入 Pspac-crtI-crtE-crtB 操纵子,首次在枯草芽胞杆菌中实现了番茄红素的生物合成。此外,可以利用该系统进行谷氨酸棒杆菌染色体基因的无痕敲除、替换及高达 179.8kb 片段的删除,反筛与突变效率分别为 100% 与 17.9-85.9%,明显高于传统的 SacB 系统。利用该方法成功地构建了直接发酵法产戊二胺的谷氨酸棒杆菌工程菌,为今后利用谷氨酸棒杆菌生产戊二胺奠定了基础。

该研究通过构建抗毒素开关调控的毒素反筛模块,成功建立了一种新型的基因编辑技术,在革兰氏阳性细菌中实现了染色体基因的无痕敲除、敲入、替换、点突变及大片段删除和插入。TCCRAS 方法具有不引入任何标记、遗传稳定、效率高、用途广等优点,其可作为一种有效的遗传操作工具用于系统生物学及合成生物学研究;同时,该方法还能够在基因组水平高效地实现对多种革兰氏阳性细菌的代谢工程改造,为人工设计构建高效的细胞工厂和新型的生物催化剂,为实现重要化合物的生物合成提供技术平台,提升微生物在医药、农业、工业等多个领域中的应用价值。

该研究进展已于近日在线发表于 ACS Synthetic Biology,中科院微生物所博士生吴杰与副研究员邓爱华为该文的第一作者,研究员温廷益与车永胜为通讯作者。该研究得到国家高技术研究发展计划(“863” 计划)(2014AA021203)、国家自然科学基金(31570083 和 31170103)、中科院科技服务网络计划(STS 计划)(KFJ-EW-STS-078)和中科院重点部署项目(KGZD-EW-606)的资助。

文章链接:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.6b00287

利用抗毒素开关调控的毒素反筛模块(TCCRAS)进行基因编辑的原理

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