陈其军
​中国农业大学生物学院的陈其军教授,专注于植物合成生物学及基因编辑技术及应用。其课题组先后建立了 MultiRound Gateway 和 MISSA 组装标准。并经过不断优化和改进,与 2017 年
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研究学习经历:

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中国农业大学生物学院的陈其军教授,专注于植物合成生物学及基因编辑技术及应用。其课题组先后建立了 MultiRound Gateway 和 MISSA 组装标准。并经过不断优化和改进,与 2017 年发表成果,建立了第二代和第三代的 MISSA 技术 (MISSA 2.0/3.0)。

生物 360 精选了谢陈其军教授在 2015-2016 年发表的 3 篇文章,翻译摘要以供读者更好的了解其工作成果。由于编辑个人翻译水平有限,如有错误感谢您的指正。

1. Zhang Hai-Yan, Wang Xing-Hui, Dong Li, Wang Zhi-Ping, Liu Bing, Lv Jie, Xing Hui-Li, Han Chun-Yan, Wang Xue-Chen, Chen Qi-Jun. MISSA 2.0: an updated synthetic biology toolbox for assembly of orthogonal CRISPR/Cas systems. 2017. 7. 41993(注:开源 paper 可下载)

MISSA 2.0:用于组装正交 CRISPR / Cas 系统的更新的合成生物学工具箱

摘要:在植物中产生多个基因的有效突变仍然是一个挑战。使用两个或更多个正交 CRISPR / Cas 系统可以产生具有多基因突变的植物,但是这些系统的装配需要强大的高容量的工具包。这里我们介绍一个能够组装两个或更多的 CRISPR / Cas 系统的广泛更新的工具箱,MISSA 2.0。我们开发了基于质粒 RK2 的新型自杀供体载体系统,与原始的基于质粒 R6K 的系统相比,它的克隆能力更高。我们通过将多个 DNA 片段装配到大肠杆菌染色体中,并通过产生组成型或诱导型过表达多种基因的拟南芥转基因植株来验证 MISSA 2.0 的效用。随后我们发现,RK2 衍生的 MISSA 2.0 供体载体的更高克隆能力促进了两个正交的 CRISPR / Cas 系统的装配,包括 SpCas9 和 SaCas9,因此促进了携带这些系统的转基因品系的产生。我们预计,MISSA 2.0 这一工具将有助于基于两个或多个正交 CRISPR / Cas9 系统的植物多重基因组编辑的发展,并且还可以实现植物合成生物学的进步。

2. Wang Z. P., Xing H. L., Dong L., Zhang H. Y., Han C. Y., Wang X. C., Chen Q. J. Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in a single generation. Genome Biol. 2015. 16. 144(注:开源 paper 可下载)

经卵细胞特异性启动子控制的 CRISPR/Cas9 能在一代的拟南芥中产生多个靶基因的有效纯合突变体

摘要:通过 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的组成型过表达产生的拟南芥突变体,在 T1 代中通常是嵌合体。在这个研究中,我们使用了卵细胞特异性启动子用来驱动 Cas9 的表达,并以高效率获得了用于多个靶基因的 T1 代非嵌合突变体。比较由 8 个启动子和 2 个终止子结合的 12 种组合发现,卵细胞特异性启动子控制的 CRISPR/Cas9 系统的效率取决于合适的终止子。并且,与单个启动子相比,通过融合 2 种卵细胞特异性启动子产生的符合启动子在 T1 代中的突变效率要高很多。

3. Xing H. L., Dong L., Wang Z. P., Zhang H. Y., Han C. Y., Liu B., Wang X. C., Chen Q. J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014. 14. 327(注:开源 paper 可下载)

用于植物的多重基因编辑的 CRISPR/Cas9 工具包

摘要

背景:为了将 CRISPR/Cas9 系统应用于各种植物,一个包含额外的植物选择性标记、更多的 gRNA 模块和更容易的单个或多个 gRNA 表达盒装配方法的工具箱,必不可少。

结果:我们开发了基于 pGreen 或 pCAMBIA 骨架的 CRISPR / Cas9 双元表达载体和 gRNA(指导 RNA)模块载体,作为植物中多重基因组编辑的工具包。 该工具包不需要 BsaI 以外的限制性酶,可以仅仅只在一个克隆步骤中高效地产生优化玉米密码子 Cas9 以及一个或多个的 gRNA 的最终构建体。 我们使用玉米原生质体、转基因玉米品系和转基因拟南芥品系来对这个工具箱进行验证,结果显示出高效率和特异性。更重要的是,使用这个工具箱,在 T1 代的转基因幼苗中检测到三个拟南芥基因的定向突变。此外,这些多基因突变可以遗传到下一代。

结论:我们开发了一个工具箱,能够促使 CRISPR/Cas9 系统在各种植物中迅速或稳定的表达。它能高效产生带有多个基因突变的突变体,因此能够助力植物研究。

拓展阅读: 中国农大权威期刊发表 CRISPR 研究

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代表性论文:

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1.Zhang HY et al. (2017). MISSA 2.0: an updated synthetic biology toolbox for assembly of orthogonal CRISPR/Cas systems. Sci. Rep. 7, 41993; doi: 10.1038/srep41993.

2.Wang ZP et al. (2015). Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in a single generation. Genome Biol 16, 144. Xing HL et al. (2014).

3.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol 14, 327.

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