Nature子刊:北大魏文胜、哈佛刘小乐课题组完成首次CRISPR lncRNA基因高通量功能筛选

学术经纬 / 2016-11-14
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CRISPR–Cas系统是近年来兴起的一种高效的基因编辑技术,具有广泛的应用范围,其中就包括功能基因筛选。人们可以建立一个单链向导RNA(sgRNA)的库,用其中的sgRNA去靶向作用于多种基因的编码区域,然后再以所研究功能相关的目标表型对结果进行评估,从而找到与该功能相关的基因。

这一策略利用了细胞中倾向于产生差错DNA修复途径——非同源性末端接合(NHEJ),通过CRISPR–Cas系统在目标基因片段中制造DNA双链断裂,是细胞采用NHEJ进行修复,最终在原断裂位点留下插入/缺失突变。对于编码蛋白的基因,少数碱基对的加入或去除便可能带来移码突变、错义突变等严重影响蛋白正常功能的因素,最终反映在表型上。

▲NHEJ过程(图片来源:acsu.buffalo.edu)

然而,对于转录非编码RNA的基因来说,上述策略则难以用于功能筛选,因为仅有插入/缺失突变很可能并不能显著影响转录产物的表型。为此,人们需要制造影响更大的突变,比如基因中大片段的缺失,以造成可观察到的表型改变,而这样的突变可以通过配对向导RNA(pgRNA)来实现。CRISPR–Cas系统在两种分别靶向目标基因不同位点的gRNA的指导下,在同一基因中造成两处DNA双链断裂。在细胞对DNA进行修复的过程中,上述两个断裂点之间的基因片段可能会被“遗漏”,最终不会出现在修复完毕的基因中。

最近,北京大学魏文胜教授和哈佛大学刘小乐教授的联合团队基于上述策略,以慢病毒为载体构建出pgRNA库,在全基因组范围内对人源肝癌细胞系Huh7.5OC中的近700个癌症或其他疾病相关长链非编码RNA(lncRNA)的基因进行了功能筛选。这一成果发表于近期的Nature子刊《Nature Biotechnology》上。

▲魏文胜教授(左)和刘小乐教授(右)(图片来源:北京大学和哈佛大学官网)

研究者以细胞增殖为表型,采用MAGeCK算法对lncRNA基因敲除影响的显著性进行了分析,最终筛选出了43种和8种在敲除后分别抑制(即负向选择)和促进(即正向选择)细胞增殖的lncRNA基因。在接下来的验证性分析中,研究者选取了5种负向选择和4种正向选择lncRNA,在Huh7.5OC细胞中对其进行了敲除、回补、转录激活或抑制处理,结果均符合其对细胞增殖或存活等方面的影响。在上述9个lncRNA中,正向选择的LINC01087还被进行了进一步的功能分析。结果显示,LINC01087的敲除导致一系列肝癌相关基因的表达上调,如FOS和FOSB等。

▲lncRNA基因功能筛选流程示意(图片来源:Nature Biotechnology)

上述lncRNA的影响很可能还不局限于肝癌。研究者们选取了15个对细胞增殖影响最显著的lncRNA,利用多个大型癌症数据库,分析了它们以及其他基因在五种癌症肿瘤中的表达,包括肝癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和多形性胶质母细胞瘤。结果显示,许多与负向选择lncRNA共表达的基因可促进RNA合成与细胞周期等过程;而许多与正向选择lncRNA共表达的基因则参与抑制上述过程。这与上述lncRNA对之前Huh7.5OC细胞增殖和存活的影响相一致。

这一工作是首次采用基于pgRNA利用CRISPR–Cas系统对lncRNA基因的高通量功能筛选研究,其基本策略和方法可被用于对其他非编码RNA功能的分析中,具有巨大的潜在应用场景。

参考资料:
[1] Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISCRISCRISCRISPR–Cas9 library
[2] Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries

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