Nature:哥伦比亚大学顾伟教授揭示乙酰化修饰对肿瘤抑制蛋白p53调控的新机制

来源:生物帮 / 作者:顾伟 / 2016-11-17
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近日,国际学术权威刊物自然出版集团《Nature》杂志在线发表了哥伦比亚大学顾伟教授实验室题为《Acetylation-regulated interaction between p53 and SET reveals a widespread regulatory mode》的研究论文,研究揭示乙酰化修饰对肿瘤抑制蛋白p53调控的新机制,并发现一类富含酸性氨基酸的蛋白(acidic domain-containing protein),其酸性 结 构域可特异 性地结合其他蛋白的非乙酰化状态的赖氨酸富集区(lysine-rich domain),作为一类新的“阅读器(reader)”读取与其相互作用的蛋白中包含的信息。

p53 被称为“基因组卫士”,是一种重要的肿瘤抑制蛋白,主要通过其作为转录因子的角色参与调控细胞中多种重要的病理、生理进程,如细胞周期调控、凋亡、衰老、代谢以及发育和分化。p53的活性受多种翻译后修饰(posttranslationalmodifications)的调节,如磷酸化、乙酰化、泛素化和甲基化等。顾伟教授实验室的研究重点侧重于p53的乙酰化修饰,先后鉴定出位于p53羧基末端结构域(C-terminal domain,CTD) 和DNA-结合结构域(DNA-bindingdomain)的多个可发生乙酰化修饰的赖氨酸位点。其中,CTD的乙酰化是第一个被发现的非组蛋白乙酰化修饰模型,因而多年来一直受到关注。虽然一系列体外实验证据显示CTD乙酰化有上调p53转录活性、增强p53-DNA相互作用的亲和力以及维持p53蛋白稳定性等功能,但一直缺乏合适的动物模型从内源性实验的角度直接证明p53 CTD乙酰化的重要性。另一方面,CTD乙酰化调控p53功能的分子机制还没有完全揭示。

作为一个经典的转录因子,p53需要招募一系列转录共激活因子(co-activator)或转录共抑制因子(co-repressor) 共同参与其对下游把基因的转录调控。CTD本身通常被认为是一个对p53起负性调控作用的结构域,很可能参与对上述因子特别是转录共抑制因子招募。而CTD乙酰化则可能通过调节CTD对这些因子的招募,来调控p53的转录活性。基于这一假设,顾伟教授实验室首先通过合成一对带有生物素标签的非乙酰化CTD肽段和乙酰化CTD肽段作为“诱饵 (bait)”,从制备的蛋白质组中筛选潜在的、其与p53相互作用受CTD乙酰化状态调控的蛋白因子。通过联合质谱分析技术,研究人员成功鉴定出促癌蛋白(oncoprotein)SET 作为一个主要的蛋白因子特异性地与非乙酰化的CTD结合,而CTD乙酰化则完全破坏这种相互作用。进一步的细胞学实验证明CTD乙酰化对p53-SET相互作用的调控在体内确实存在。需要指出的是发生在CTD赖氨酸残基上的其他翻译后修饰如甲基化、泛素化和类泛素化(包括sumoylation和neddylation)则对p53-SET的相互作用没有影响。功能上,SET作为p53的转录共抑制因子通过与p53的相互作用被招募到p53下游靶基因的启动子区,发挥抑制p53转录活性的作用。SET不影响p53的翻译后修饰、蛋白稳定性以及p53在其靶基因启动子区的结合能力,其转录抑制活性是通过抑制乙酰基转移酶p300/CBP对p53靶基因启动子区组蛋白H3K18/H3K27的乙酰化来实现的。在细胞应对DNA损伤时,p53的蛋白水平以及其在下游靶基因启动子区的富集程度均显著增加,而细胞中SET的蛋白水平没有明显变化。但是,由于此应激条件下p53 CTD 乙酰化水平的升高,明显地抑制了p53-SET的相互作用以及SET在p53下游靶基因启动子区的富集。 这一发现揭示了一个新的CTD乙酰化的分子调控机制,即CTD乙酰化通过破坏转录共抑制因子与p53的相互作用,“去抑制 (de-repress)” p53的转录活性。

肿瘤细胞往往不能耐受野生型p53的存在,超过50%的人类肿瘤中发现 p53 基因的缺失或突变。然而,仍然有一类肿瘤保有野生型p53,但其活性受到明显的抑制。因此上调该类肿瘤中野生型p53的活性可作为一种有意义的治疗手段。SET 作为促癌蛋白在多种类型的肿瘤中呈现过表达(overexpression)的状态,研究人员发现,在p53野生型的肿瘤细胞中,下调内源性SET的表达,显著上调野生型p53的活性,进而抑制肿瘤细胞的体外增值以及肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内的成瘤能力。为了进一步研究SET对内源性野生型p53活性的调节作用,研究人员通过RNA-seq分析,发现了数十个p53下游靶基因的表达同样以p53依赖的方式受SET的调节,而这些基因在功能上并不仅局限于某一个方面,证明SET对内源性p53活性调节的普遍性意义。为了研究生理条件下SET对p53的作用,研究人员建立了条件性 Set 基因敲除 (Set conditional KO) 的小鼠模型。纯合性 Set 基因敲除的小鼠呈现出胚胎期致死的表型,其胚胎中p53下游靶基因 p21 和 Puma 的表达显著增加,提示 Set 基因敲除上调胚胎中p53的活性。此外,通过腺病毒感染的方式在条件性 Set 基因敲除的小鼠胚胎纤维细胞(MEFs)中表达内切酶Cre来敲除 Set 的表达,同样发现p53靶蛋白p21 和Puma表达的上调,进一步证明SET是一个重要的内源性p53调节因子。

生物化学分析 发现 ,p53 CTD与SET的酸性结构域(acidicdomain)直接结合。p53 CTD是一个赖氨酸富集区,呈正电性;SET的酸性结构域富含酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸,呈高度的负电性。因此,研究人员推测,这种相互作用可能基于两个结构域之间的电荷效应。当赖氨酸发生乙酰化修饰,其带有的正电荷被中和,两个结构域之间失去了电荷效应,因此相互作用被破坏。基于这一假设,研究人员发现其他含有酸性结构域的蛋白VPRBP,DAXX和PELP1以同样的模式与p53 CTD结合,并且这种结合被p53 CTD乙酰化所破坏。另一方面,研究人员还发现组蛋白H3,KU70和FOXO1也含有可被乙酰化修饰的赖氨酸富集区并且这些赖氨酸富集区可以与SET的酸性结构域直接作用。相似的,这些相互作用同样被乙酰化修饰所拮抗。以往的研究认为乙酰化修饰可作为一个“标记”招募含有bromo结构域 (bromodomain)的“阅读器”来“解码”乙酰化修饰中包含的信息。而顾伟教授实验室的研究提示酸性结构域可以作为一种新的、广泛存在的“阅读器”来解码非乙酰化状态下蛋白包含的信息。进一步应用生物信息学分析发现,人类蛋白质组中普遍存在含有赖氨酸富集区的蛋白和含有酸性结构域的蛋白,未来通过研究乙酰化修饰对这些潜在相互作用的调节,可能进一步揭示酸性结构域作为“阅读器”的普遍性。

为了进一步探索p53 CTD乙酰化的作用,研究人员构建了模拟CTD乙酰化状态的突变 p53 ( p53 KQ/KQ )小鼠模型。该模型的纯合性小鼠呈现出生后致死(neonatal lethal)的表型,多个组织中表现出普遍增强的p53活性。从该小鼠模型分离得到小鼠胚胎纤维细胞表现出明显的细胞增殖障碍和细胞衰老的特征,并且其表达的与增殖障碍和衰老相关的p53下游蛋白标志p21明显升高。这些表型进一步证明p53 CTD乙酰化在生理状态下的重要作用。此外,研究人员还发现,与野生型p53相互作用的含有酸性结构域的蛋白Set、Vprbp、Daxx和Pelp1不能与p53 KQ 相互作用,提示失去这一类蛋白对内源性p53的调控可能是p53 KQ 活性增强的机制之一。

原文链接:http://www.nature.com/nature/journal/v538/n7623/full/nature19759.html

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